Genotoxicidad de herbicidas de importancia agroeconómica en Argentina

Los estudios llevados a cabo en el presente trabajo de Tesis Doctoral, tuvieron como objetivo general, evaluar la capacidad deletérea del herbicida flurocloridona y de dos de sus formulaciones comerciales Twin Pack Gold® y Rainbow® empleadas en el agro de nuestro país conteniendo un 25% del principio activo. Estos formulados se emplean en el tratamiento de cultivos agrícolas como algodón, apio, arveja, avena, cebada, centeno, lenteja, perejil, zanahoria, caña de azúcar, girasol, papa y trigo, entre otros. Para evaluar la toxicidad del mencionado herbicida y de sus formulaciones comerciales, se emplearon como modelo de estudio in vitro dos líneas celulares de mamífero (CHO-K1 y HepG2) y como modelo in vivo larvas del anfibio anuro Rhinella arenarum. Los efectos genotóxicos de dichos herbicidas, fueron investigados mediante el estudio de biomarcadores de efecto, analizando la frecuencia de intercambios de cromátidas hermanas (ICHs) y los ensayos cometa (EC) y de micronúcleos (MN). En la línea celular CHO-K1 todos los compuestos ensayados fueron capaces de inducir ICHs con concentraciones de 0,25-15 μg/ml. La capacidad de los compuestos para inducir ICHs fue: Twin Pack Gold® > FLC > Rainbow®. El formulado comercial Twin Pack Gold® fue el único compuesto capaz de incrementar la frecuencia de MN con la concentración de 5 μg/ml. Además, las mayores concentraciones ensayadas de ambos formulados (10-15 μg/ml) resultaron ser citotóxicas tal cual fue evidenciado a través de cambios morfológicos, pérdidas de la integridad de la membrana plasmática y alteraciones nucleares que no permitieron monitorear la frecuencia de MN. Todos los compuestos fueron capaces de inducir rupturas de cadena simple y/o sitios álcali sensibles en el ADN, evidenciado mediante la variante alcalina del EC con todas las concentraciones ensayadas. En células HepG2, al igual que en las células CHO-K1, sólo el formulado Twin Pack Gold® fue capaz de incrementar la frecuencia de MN a la concentración de 5 μg/ml, no pudiéndose monitorear la frecuencia de MN con las concentraciones de 10-15 μg/ml de ambos formulados comerciales debido a la aparición de alteraciones celulares como ocurrió en el sistema celular CHO-K1. El análisis de los compuestos estudiados evidenció que fueron capaces de inducir rupturas de cadena simple y/o sitios álcali sensibles en el ADN con todas las concentraciones ensayadas lo cual fue evidenciado mediante el análisis de los nucleoides obtenidos en el EC. Los efectos citotóxicos fueron evaluados mediante el análisis del índice de proliferación celular (IPC), el índice mitótico (IM), el índice de división nuclear (IDN), los ensayos colorimétricos de captación de Rojo Neutro y MTT (RN y MTT, respectivamente) y el estudio de muerte celular programada o apoptosis. En la línea celular CHO-K1 los resultados revelaron que el IPC decrece en función de la concentración empleada de todos los compuestos ensayados y para una concentración dada, la capacidad de ambas formulaciones comerciales de inducir un retraso en la progresión del ciclo celular siempre fue mayor que la inducción producida por el principio activo FLC. Asimismo, se observó actividad mitodepresiva ejercida tanto por el principio activo como por los formulados comerciales. Asimismo, se observó una marcada reducción de la actividad mitocondrial con las mayores concentraciones ensayadas de todos los compuestos. Cuando se realizó el ensayo de RN únicamente la formulación comercial Rainbow® ejerció efecto citotóxico a nivel lisosomal. El estudio de la viabilidad celular evidenció que los formulados comerciales resultaron ser más citotóxicos que el principio activo FLC. En células HepG2 se observó que solamente los formulados comerciales fueron capaces de inducir una alteración de la actividad mitocondrial y lisosomal. Además, se observó inducción de apoptosis cuando las células fueron expuestas durante 24 h a todos los compuestos. En sistemas in vivo, de larvas de R. arenarum, se determinó una CL5096 h con valores de 2,96 mg/L para Twin Pack Gold® y de 2,85 mg/L para Rainbow®. Sólo el formulado Rainbow® fue capaz de incrementar a las 48 h de exposición la frecuencia de MN en eritrocitos circulantes con la concentración de 0,71 mg/L. Por el contrario, ambos formulados fueron capaces de inducir efecto genotóxico con todas las concentraciones empleadas tanto a las 48 como a las 96 h de exposición evaluadas mediante el EC. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se propuso que la respuesta diferencial encontrada en cada modelo de estudio frente a los compuestos podría deberse a la presencia de xenobióticos de naturaleza desconocida presentes en el excipiente de las formulaciones comerciales, así como a variaciones en la sensibilidad diferencial de los modelos en estudio. Los resultados de los estudios de mortalidad, genotoxicidad y citotoxicidad de FLC, Twin Pack Gold® y Rainbow® obtenidos en el desarrollo de la presente Tesis Doctoral, representan una evidencia concreta de que el herbicida FLC debe ser tenido en cuenta como un agente inductor de daño genotóxico y citotóxico, y debería ser clasificado, según los valores de toxicidad aguda CL5096 h obtenidos mediante la exposición de larvas de R. arenarum a Twin Pack Gold® y Rainbow®, como compuesto tóxico (categoría II), siguiendo la clasificación propuesta por Instituciones reguladoras tales como OECD y UN. Asimismo, se sugiere la necesidad de una correcta evaluación toxicológica de FLC y de las formulaciones comerciales existentes del herbicida antes que continúen siendo aplicadas masivamente en nuestro país y en el mundo, representando un factor de riesgo para los organismos expuestos, incluyendo al ser humano.Directores de la tesis: Sonia Soloneski y Marcelo L. LarramendyFacultad de Ciencias Naturales y Muse

Genotoxicity and Cytotoxicity Exerted by Pesticides in Different Biotic Matrices-An Overview of More Than a Decade of Experimental Evaluation

Agrochemicals represent one of the most important sources of environmental pollution. Although attempts to reduce agrochemical use through organic agricultural practices and the use of other technologies to control pests continue, the problem is still unsolved. Recent technological advances in molecular biology and analytical science have allowed the development of rapid, robust, and sensitive diagnostic tests (biomarkers) that can be used to monitor exposure to, and the effects of pollution. One of the major goals of our research laboratory is to evaluate comparatively the genotoxic and cytotoxic effects exerted by several pure agrochemicals and their technical formulations commonly used in Argentina on vertebrate cells in vitro and in vivo employing several end-points for geno and cytotoxicity. Among them are listed the herbicides dicamba and flurochloridone, the fungicide zineb, the insecticides pirimicarb and imidacloprid. Overall, the results clearly demonstrated that the damage induced by the commercial formulations is in general greater than that produced by the pure pesticides, suggesting the presence of deleterious components in the excipients with either a putative intrinsic toxic effect Larramendy et al. 4 or with the capacity of exacerbating 52 the toxicity of the pure agrochemicals, or both. Accordingly, the results highlight that: 1) A complete knowledge of the toxic effect/s of the active ingredient is not enough in biomonitoring studies; 2) Pesticide/s toxic effect/s should be evaluated assaying to the commercial formulation available in market; 3) The deleterious effect/s of the excipient/s present within the commercial formulation should not be either discarded nor underestimated, and 4) A single bioassay is not enough to characterize the toxicity of a agrochemical under study.Fil: Larramendy, Marcelo Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo. Cátedra de Citología; ArgentinaFil: Nikoloff, Noelia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo. Cátedra de Citología; ArgentinaFil: Ruiz de Arcaute, Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo. Cátedra de Citología; ArgentinaFil: Soloneski, Sonia Maria Elsa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo. Cátedra de Citología; Argentin

Genotoxicity and Cytotoxicity Exerted by Pesticides in Different Biotic Matrices-An Overview of More Than a Decade of Experimental Evaluation

Agrochemicals represent one of the most important sources of environmental pollution. Although attempts to reduce agrochemical use through organic agricultural practices and the use of other technologies to control pests continue, the problem is still unsolved. Recent technological advances in molecular biology and analytical science have allowed the development of rapid, robust, and sensitive diagnostic tests (biomarkers) that can be used to monitor exposure to, and the effects of pollution. One of the major goals of our research laboratory is to evaluate comparatively the genotoxic and cytotoxic effects exerted by several pure agrochemicals and their technical formulations commonly used in Argentina on vertebrate cells in vitro and in vivo employing several end-points for geno and cytotoxicity. Among them are listed the herbicides dicamba and flurochloridone, the fungicide zineb, the insecticides pirimicarb and imidacloprid. Overall, the results clearly demonstrated that the damage induced by the commercial formulations is in general greater than that produced by the pure pesticides, suggesting the presence of deleterious components in the excipients with either a putative intrinsic toxic effect Larramendy et al. 4 or with the capacity of exacerbating 52 the toxicity of the pure agrochemicals, or both. Accordingly, the results highlight that: 1) A complete knowledge of the toxic effect/s of the active ingredient is not enough in biomonitoring studies; 2) Pesticide/s toxic effect/s should be evaluated assaying to the commercial formulation available in market; 3) The deleterious effect/s of the excipient/s present within the commercial formulation should not be either discarded nor underestimated, and 4) A single bioassay is not enough to characterize the toxicity of a agrochemical under study.Facultad de Ciencias Naturales y Muse

Introducción a la Citogenética

La citogenética es la rama de la genética que estudia la estructura, número, morfología y comportamiento del ADN que se condensa durante la división celular, con participación de proteínas para formar los cromosomas. Esta ciencia surgió a comienzos del siglo XX para explicar las leyes de Mendel mediante el comportamiento cromosómico por fusión de dos disciplinas, la citología y la genética, heredando de la primera los aspectos cualitativos, físicos y descriptivos, y de la segunda los enfoques cuantitativos y fisiológicos. Desde ese entonces, se ha avanzado en el desarrollo de técnicas y metodologías que brindan valiosos aportes en la resolución de problemas diagnósticos, taxonómicos y evolutivos, entre tantos otros, de diversos grupos animales y vegetales. Adicionalmente, estas tecnologías son ampliamente utilizadas en medicina y, mediante el análisis de tejidos, sangre o médula ósea, se identifican cambios en los cromosomas, como cromosomas rotos, faltantes o adicionales, cambios que pueden ser signo de una enfermedad genética, o de algunos tipos de cáncer. En el presente capítulo se abordará la estructura, función y comportamiento de los cromosomas junto con las anormalidades que pueden presentar.Facultad de Ciencias Naturales y Muse

Effect of eicosapentaenoic acid on bovine cumulus–oocyte complex in vitro

The aim of the present study was to investigate the effects of eicosapentaenoic acid (EPA) supplementation during in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes. The concentrations tested in all experiments were 1 nM, 1 μM, and 1 mM EPA. The effect of EPA was evaluated on cumulus‐oocyte complexes (COC) by oocyte maturation (cumulus expansion area and oocyte nuclear maturation), genotoxicity [single cell gel electrophoresis (SCGE)], and cytotoxicity (apoptosis, viability, and MTT assays) end points. The maturation parameters were affected by exposure of COC to different EPA concentrations in the IVM medium. Cumulus expansion area increased in the presence of 1 nM EPA (P < 0.05) whereas addition of 1 nM EPA (P < 0.05) decreased cumulus expansion after 24 h of IVM. Moreover, the maturation rate significantly decreased when 1 mM of EPA was assayed (P < 0.001). EPA at 1 nM induced genotoxic and cytotoxic effects on bovine cumulus cells (CC) and primary DNA lesions (P < 0.001). A significant increase in the frequency of apoptotic (P < 0.01) and necrotic (P < 0.001) cells was observed after 24 h of treatment with 1 nM, 1 μM, and 1 mM EPA. Mitochondrial activity was altered with 1 mM EPA (P < 0.001). We inferred that optimal oocyte quality was partially dependent on the presence of adequate EPA concentrations; EPA could be beneficial to improve oocyte quality in the maturation process, because low concentration tested (1 nM EPA) improved cumulus expansion.Instituto de Genética Veterinari

High copper concentrations produce genotoxicity and cytotoxicity in bovine cumulus cells

The aim of this study was to investigate the cytotoxic and genotoxic effects of high copper (Cu) concentrations on bovine cumulus cells (CCs) cultured in vitro.We evaluated the effect of 0, 120, 240, and 360 μg/dL Cu added to in vitro maturation (IVM) medium on CC viability assessed by the trypan blue (TB)–fluorescein diacetate (FDA) and 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assays, apoptosis, and DNA damage. Differences in cell viability assessed by TB–FDAwere not significant among CC treated with 0, 120, 240, and 360 μg/dL Cu. However, mitochondrial activity assessed by MTT was lower in CC cultured with 120, 240, and 360 μg/dL Cu as compared with the control (p < 0.01). Percentages of apoptotic cells were higher when CCs were treated with 120, 240, and 360 μg/dL Cu (p < 0.05) due to higher frequencies of late apoptotic cells (p < 0.05). The frequency of live cells diminished in a dose-dependent manner when Cu was added to the culture medium. Whereas genetic damage index (GDI) increased significantly in CC cultured in the presence of 240 and 360 μg/dL Cu (p ˂ 0.05), DNA damage increased at all Cu concentrations tested (p ˂ 0.05). These results indicate that Cu induces cytotoxic and genotoxic effects in bovine CC.Facultad de Ciencias VeterinariasInstituto de Genética VeterinariaFacultad de Ciencias Médica

The presence of acylated ghrelin during in vitro maturation of bovine oocytes induces cumulus cell DNA damage and apoptosis, and impairs early embryo development

The aim of this study was to investigate the effects of acylated ghrelin supplementation during in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes. IVM medium was supplemented with 20, 40 or 60 pM acylated ghrelin concentrations. Cumulus expansion area and oocyte nuclear maturation were studied as maturation parameters. Cumulus–oocyte complexes (COC) were assessed with the comet, apoptosis and viability assays. The in vitro effects of acylated ghrelin on embryo developmental capacity and embryo quality were also evaluated. Results demonstrated that acylated ghrelin did not affect oocyte nuclear maturation and cumulus expansion area. However, it induced cumulus cell (CC) death, apoptosis and DNA damage. The damage increased as a function of the concentration employed. Additionally, the percentages of blastocyst yield, hatching and embryo quality decreased with all acylated ghrelin concentrations tested. Our study highlights the importance of acylated ghrelin in bovine reproduction, suggesting that this metabolic hormone could function as a signal that prevents the progress to reproductive processes.Instituto de Genética Veterinari

Efecto de la suplementación con ghrelina al medio de cultivo sobre la frecuencia de apoptosis de celulas del cúmulus

La apoptosis, también conocida como muerte celular programada, es un proceso altamente regulado y crucial en todos los organismos multicelulares. Si bien se ha demostrado, tanto en estudios in vivo como in vitro, que las células de la granulosa mueren a través del proceso activo de apoptosis, la información sobre este fenómeno en células del cúmulus (CC) durante la maduración in vitro (MIV) es todavía muy limitado. En algunos estudios se ha encontrado una relación inversa entre la tasa de apoptosis de las CC que rodean al ovocito y su capacidad de desarrollo posterior. Estudios en diferentes especies reportan que altas concentraciones de ghrelina, una hormona gastrointestinal sintetizada principalmente en las células oxínticas del estómago, podrían afectar negativamente la maduración de los ovocitos, afectando así el desarrollo preimplantacional de los embriones.El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de ghrelina sobre la tasa de apoptosis en las CC durante la MIV de ovocitos bovinos.Facultad de Ciencias Médica

Evaluación del daño genómico en células del cúmulus inducido por la hormona ghrelina

Las células del cúmulus (CC), que rodean a los ovocitos durante la maduración, juegan un rol importante en su capacidad de desarrollo posterior hasta el estadio de blastocisto. Esto se debe a que las células se hallan unidas a través de uniones gap que conectan a las células del cúmulus entre sí y con el ovocito, interviniendo en el soporte metabólico del mismo.Si bien se ha demostrado, tanto en estudios in vivo como in vitro, que las células de la granulosa mueren a través del proceso activo de apoptosis, la información sobre este fenómeno en CC durante la maduración in vitro (MIV)es todavía muy limitada. El daño en el ADN puede ser el producto final del fenómeno de apoptosis o uno de los responsables de su desarrollo. La ghrelina es un péptido gastrointestinal sintetizado principalmente en las células oxínticas del estómago y el abomaso en los bovinos. Se descubrió que también puede ser sintetizada en otros tejidos, incluido los órganos reproductivos, ejerciendo tanto efectos endócrinos como parácrinos. Estudios en diferentes especies reportan que altas concentraciones de ghrelina podrían afectar negativamente la maduración de los ovocitos, afectando así el desarrollo preimplantacional de los embriones.El objetivo del presente trabajo fue evaluar el daño del ADN de las CC expuestas a diferentes concentraciones de ghrelina durante la MIV de ovocitos bovinos.Facultad de Ciencias Médica

Evaluación del daño genómico en células del cúmulus inducido por la hormona ghrelina

Las células del cúmulus (CC), que rodean a los ovocitos durante la maduración, juegan un rol importante en su capacidad de desarrollo posterior hasta el estadio de blastocisto. Esto se debe a que las células se hallan unidas a través de uniones gap que conectan a las células del cúmulus entre sí y con el ovocito, interviniendo en el soporte metabólico del mismo.Si bien se ha demostrado, tanto en estudios in vivo como in vitro, que las células de la granulosa mueren a través del proceso activo de apoptosis, la información sobre este fenómeno en CC durante la maduración in vitro (MIV)es todavía muy limitada. El daño en el ADN puede ser el producto final del fenómeno de apoptosis o uno de los responsables de su desarrollo. La ghrelina es un péptido gastrointestinal sintetizado principalmente en las células oxínticas del estómago y el abomaso en los bovinos. Se descubrió que también puede ser sintetizada en otros tejidos, incluido los órganos reproductivos, ejerciendo tanto efectos endócrinos como parácrinos. Estudios en diferentes especies reportan que altas concentraciones de ghrelina podrían afectar negativamente la maduración de los ovocitos, afectando así el desarrollo preimplantacional de los embriones.El objetivo del presente trabajo fue evaluar el daño del ADN de las CC expuestas a diferentes concentraciones de ghrelina durante la MIV de ovocitos bovinos.Facultad de Ciencias Médica